超大尺度Ribo-seq挖掘lncRNA编码功能性微肽，解锁水稻增产全新遗传资源

超大尺度多组学数据集搭建，系统挖掘水稻非经典翻译全景

核糖体图谱（Ribo-seq）是精准捕捉真实翻译事件的核心工具，依靠核糖体保护片段特有的3nt周期性特征，可清晰区分转录水平与翻译水平的基因表达变化，弥补单纯转录组无法解析翻译层面调控的短板。为完整绘制水稻全基因组非经典翻译图谱，研究团队整合107套公共Ribo-seq测序数据，补充体细胞胚诱导、分化阶段独有组织样本自建测序文库，最终构建包含27.3亿核糖体保护片段的超大翻译组数据集，样本覆盖愈伤、体细胞胚、幼苗、根、茎、叶片、穗、小穗水稻全生育期各类关键组织。

研究同步整合链特异性全长转录组测序数据，注释得到总计24,855条水稻lncRNA，其中包含2,054条本研究从头组装、此前未被报道的全新lncRNA。研究搭建融合Price、RiboCode、RiboTish等五种无监督ORF识别算法的整合分析流程，对全部测序数据进行统一筛选去冗余，最终在水稻基因组鉴定出28,717个非经典翻译开放阅读框，分为上游（uORF）、下游（dORF）和lncRNA来源（lncORF）三大类别，其中lncORF共计8,253个。对比此前已发表水稻相关翻译研究，本次鉴定的lncORF数量实现量级提升，彻底填补水稻lncRNA翻译组大规模资源空白。

团队依托多维度数据对比解析lncORF专属翻译规律，和经典蛋白编码基因相比，lncORF转录整体表达波动平缓，但翻译效率在不同组织间差异极大，拥有极强组织特异性，幼穗、小穗组织内翻译活性整体显著更高。在翻译起始保守序列层面，lncORF起始密码子周边Kozak基序相似度远低于标准mRNA编码区；同时翻译型lncRNA拥有更高GC含量与更稳定RNA二级结构。研究基于翻译、序列、结构多维度特征差异训练XGBoost机器学习分类模型，实现翻译型lncRNA高效精准预判，为玉米、小麦等其他禾本科作物开展同类lncORF挖掘工作提供通用标准化分析工具。

水稻中非典型翻译开放阅读框的全基因组鉴定

多层级实验验证微肽真实存在，系统解析理化结构特征

仅依靠Ribo-seq预测无法证明lncORF能够稳定合成多肽产物，研究结合大规模公共质谱与原生质体内生化实验完成多层级实体验证。团队整合1,188套水稻公共质谱数据集开展肽段匹配检索，总共鉴定到776条存在内源质谱信号的lncORF编码微肽；随机挑选15个候选lncORF构建HA标签表达载体转化水稻原生质体，蛋白免疫印迹检测结果显示10个可稳定检出对应微肽，其中4个同时获得质谱数据双重佐证，直接证明水稻细胞内大量lncRNA翻译产物真实稳定积累。

在理化性质解析层面，lncORF编码微肽分子量整体远小于常规功能蛋白，整体疏水性更强，甲硫氨酸、亮氨酸、半胱氨酸等易发生修饰的氨基酸占比显著偏高，该特征预示这类微肽更易参与膜结合相关分子互作。研究借助AlphaF2/AlphaF3工具完成微肽三维结构预测，结果显示超过43%的氨基酸序列属于无序卷曲区域，超半数微肽仅能形成单一α螺旋或β折叠简单二级结构，整体分子柔性高，适配小分子调控因子的功能定位。不同lnc微肽亚细胞分布存在明显分化，lncPEP1集中定位于细胞核，lncPEP2、lncPEP3分布于叶绿体，lncPEP4在细胞质形成点状聚集，差异化的细胞定位也对应各类微肽截然不同的生理调控通路。

lncORF编码的微肽的特性与验证

进化与群体基因组证据：lncORF属于水稻新生遗传变异库

研究选取15种禾本科植物搭配拟南芥作为外类群开展全基因组序列比对，系统解析全部lncORF进化保守特征。分析结果显示绝大多数lncORF仅在稻属物种内部存在同源序列，跨禾本科物种同源性极低，证明lncORF属于基因组从头起源的年轻遗传元件。进化选择压力分析显示lncORF区域dN/dS比值偏高，序列变异容忍度更高；结合4,726份水稻群体重测序数据可见，携带lncORF的基因组区域核苷酸多样性显著高于经典短编码基因，是水稻自然遗传变异的核心重要来源之一。

团队整合水稻GWAS公共数据库内全部农艺关联变异位点，总计定位2645个与lncORF重叠的性状变异区域，变异类型覆盖UTR突变、错义突变、沉默突变等多种形式，关联性状多达218类，涵盖株型发育、生物胁迫、非生物胁迫、籽粒产量、育性等育种核心指标，从群体遗传层面直接证实lncRNA编码微肽广泛参与水稻各类生长发育进程，具备极高的育种挖掘与利用潜力。

大田转基因功能解析，lncPEP1正向调控水稻穗发育与籽粒产量

研究筛选4条稻属高度保守、穗部优势表达的代表性lncORF（lncPEP1/2/3/4），分别构建三类遗传材料：组成型过表达株系lncPEP-OE、ATG起始密码突变无肽对照lncPEPm-OE、CRISPR敲除突变体，多年水田种植系统观测各类株系农艺性状差异。

lncPEP1是核心增产微肽，GUS组织染色结果明确其特异性在幼穗、茎秆维管束中表达。lncPEP1过表达株穗轴明显增粗，穗部一级、二级分枝数量大幅提升；解剖穗下节间组织可见株内大小维管束数量显著多于野生型，维管束发育更完善，光合产物向籽粒运输效率提升。大田产量统计数据显示，过表达植株单株籽粒数量提升11%左右，整体总产量显著上涨；而CRISPR敲除突变体维管束发育受阻，旗叶光合速率明显下降，植株生物量与单株产量同步大幅降低。转录组富集分析表明lncPEP1能够正向调控细胞壁、木质素合成与光合相关通路基因，敲除株系叶绿素合成通路显著受到抑制，完整阐明该微肽调控水稻产量的分子通路逻辑。其余三条微肽功能存在明显分化，lncPEP2过表达可同步增大籽粒长宽，千粒重提升2.9%至4.8%；lncPEP4对籽粒宽度存在负向调控作用，过表达后籽粒明显变窄；lncPEP3过表达或敲除处理均不会对水稻产量、粒型相关性状产生显著影响，四类微肽功能差异化特征，能够满足定向改良不同水稻农艺性状的育种需求。

水稻中lncORF编码的选定微肽的功能验证

综上所述，该研究依托迄今为止规模最大的水稻全组织核糖体图谱数据集，系统鉴定8,253个lncORF，结合质谱、跨物种进化、群体GWAS、转基因大田多层级证据链，证实lncORF编码的微肽真实存在并精准调控水稻穗部发育、维管束建成与籽粒产量，克隆得到具有增产效应的关键微肽lncPEP1。研究重新定义植物基因组编码潜力，打破传统编码基因育种研究局限，为水稻高产分子设计育种、其他禾本科作物遗传改良提供全新理论框架、海量遗传资源与标准化多组学分析方案。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.devcel.2026.01.010